Logo
Logo

Patch-clamp

Введение
Клеточные ионные каналы
Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов. Каждая клетка должна обмениваться с внешней средой различными веществами и, в частности, ионами. Перенос ионов через мембрану играет важную роль в процессах возбуждения клетки и передачи сигналов. Ионы проникают в клетку и выходят из нее через встроенные в мембрану белки — каналы. Каналы — это белки, которые выполняют функцию мембранных пор, так как формируют отверстия, сквозь которые могут проходить ионы. Мембранные каналы селективны—проницаемы только для определенных веществ. Селективность обусловлена радиусом пор и распределением заряженных функциональных групп в них. Существуют каналы, селективно пропускающие ионы натрия (натриевые каналы), а также калиевые, кальциевые и хлорные каналы. (см. рис. 1)
Бывают светочувствительные ионные каналы -- канальные родопсины. Эти каналы переходят из закрытого состояния, в котором они непроницаемы для ионов, в открытое, поглощая фотоны определенной длины волны (см. рис 2). Далее белок проходит через несколько промежуточных состояний, чтобы вернуться из открытого состояния в закрытое (в дальнейшем мы будем считать, что
в промежуточных состояниях канал также непроницаем для любых ионов).
Биофизические методы изучения каналов: Patch-clamp
Благодаря свободному пропусканию заряженных частиц (ионов) каналы в открытом состоянии эффективно увеличивают электрическую проводимость клеточной мембраны. Для изучения электрических свойств мембраны и изучения свойств ионных каналов существует метод локальной фиксации потенциала (Patch-clamp). Метод заключается в том, что стеклянная пипетка образует с клеточной мембраной контакт с сопротивление в несколько гигаом – это так называемый гигаомный контакт. В пипетку, заполненную электролитом, помещается электрод, второй электрод помещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Для того, чтобы производить измерения тока, протека ющего через полную клеточную мембрану, ее кусочек, заключенный внутри пипетки, пробивается избыточным давлением. Такой метод измерения называется Whole-cell patch-clamp (дословно «полноклеточный пэтч-клэмп», см. рис. 3). Эффективная электрическая схема такая: один из электродов снаружи клетки, а второй — внутри.
Часть А. Вольтамперные характеристики каналов
Одной из характеристик, которую можно измерить для каналов, является их ВАХ. ВАХ канального родопсина—это зависимость стационарного тока от приложенного к клеточной мембране напряжения посредством электродов. ВАХ зависит от состава растворов, в которых производятся измерения.
В этой части вы будете обрабатывать экспериментальные данные снятые для канального родопсина, который пропускает положительные одновалентные ионы: натрий, калий и водород.
В приложении даны зависимости силы тока, проходящего через мембранные канальные родопсины при включении света, от времени для трех разных растворов, омывающих измеряемую клетку. Концентрации ионов во внеклеточной жидкости в трех случаях:
1. $\mathrm{[H]}$ = $10^{-7.5}$ моль/л (pH=7.5), $\mathrm{[Na]}$ = 140 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 140 ммоль/л
2. $\mathrm{[H]}$ = $10^{-7.5}$ моль/л (pH=7.5), $\mathrm{[Na]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 140 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 140 ммоль/л
3. $\mathrm{[H]}$ = $10^{-6.0}$ моль/л (pH=6.0), $\mathrm{[Na]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 140 ммоль/л
Внутриклеточный раствор задается раствором, который наливается в пипетку. Он во всех трех экспериментах одинаковый:
$\mathrm{[H]}$ = $10^{-7.5}$ моль/л (pH=7.5), $\mathrm{[Na]}$ = 110 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 110 ммоль/л
\textbf{Напряжение, при котором плюс находится внутри клетки, считается положительным. Сила тока, при котором положительно заряженные частицы текут изнутри клетки наружу, считается положительной.}
A1  1.50 Постройте ВАХи канального родопсина в трех экспериментах.
Другой характеристикой, описывающей канальные родопсины, которую можно измерить, является проницаемость для разных ионов. Проницаемости для $\mathrm{Na}, \mathrm{K}$ и протонов будем обозначать $P_\mathrm{Na}; P_\mathrm{K}; P_\mathrm{H}$. Проницаемость является характеристикой мембраны с каналами: она зависит от количества каналов, но не зависит от омывающих мембрану растворов. Отношение же проницаемостей для двух разных ионов не зависит от количества каналов и является наиболее фундаментальной характеристикой канальных родопсинов.
Проницаемость входит в уравнение Гольдмана-Ходжкина-Катца, которое связывает ток через мембрану с напряжением на ней:
$$
J(u)=\cfrac{z^2e^2u}{kT} \cfrac{P_{out}c_{out}-P_{in}c_{in}\,\mathrm{exp}\left(\cfrac{zeu}{kT}\right)}{1-\mathrm{exp}\left(\cfrac{zeu}{kT}\right)}
$$
где $J$ -- сила тока, $u$ -- приложенное к мембране напряжение, $e$ -- элементарный заряд, $z$ -- зарядовое число пропускаемого иона, $k$ — постоянная Больцмана, $T = 24 {}^\circ\mathrm{C}$ -- температура во время проведения эксперимента, $P_{out}$ и $c_{out}$ — проницаемость и концентрация для иона, который находится во внеклеточном растворе, $P_{in}$ и $c_{in}$ —проницаемость и концентрация для иона, который находится внутри клетки.
Считайте, что за время эксперимента, составы растворов снаружи и внутри клетки
остаются неизменными.
A2  4.00 Постройте графики и с помощью них определите отношения $\cfrac{P_\mathrm{K}}{P_\mathrm{Na}}$ и $\cfrac{P_\mathrm{H}}{P_\mathrm{Na}}$.
Часть B. Спектр действия канальных родопсинов
Другой фундаментальной характеристикой канальных родопсинов является их спектр действия. Спектр действия — это зависимость заряда проходящего через клеточную мембрану с каналами от длины волны возбуждающего света.
Для измерения спектра действия канального родопсина, исследуемую клетку облучают ультракороткими вспышками лазера (продолжительностью 5 нс; импульсы содержат одинаковое количество фотонов на вспышку для разных длин волн) и измеряют ток (см. рис 4).
Заряд q, проходящий через мембрану, считается за время полузатухания тока. Полученная зависимость $q(\lambda)$ нормируется на максимальное значение заряда $q_\max = q (\lambda_\max)$.
B1  2.50 Постройте спектр действия канального родопсина. Определите положение максимума спектра $\lambda_\max$.
Часть C. Параметры фотоцикла
Во введении говорилось, что канал при поглощении фотонов проходит несколько промежуточных состояний и возвращаются в начальное закрытое состояние. Все эти состояния вместе называются фотоциклом (см. рис 5, на котором показан фотоцикл, в котором одно промежуточное состояние $I, C$ и $O$ – закрытое и открытое состояния соответственно). Переходы между этими состояниями происходят с некоторой вероятностью. Переход из закрытого состояния в открытое невозможен без поглощения света. При наличии света этот переход также происходит с некоторой вероятностью. Вероятность перехода между двумя состояниями $A$ и $B$ описывается величиной $\tau$ -- характерное время перехода из $A$ в $B$. Это время определяется, как обратная производная вероятности перехода по времени: $\tau_{AB}=\left(\cfrac{dp}{dt}\right)^{-1}$ (то есть вероятность перехода за время $dt$ равна $dp$).
C1  1.00 Используя все экспериментальные данные, полученные выше, определите параметры фотоцикла канального родопсина $\tau_{OI}$ и $\tau_{IC}$.
Часть D. Селективность канального родопсина
Одной из важнейших характеристик канальных родопсинов является их селективность. Селективность — это способность пропускать ионы только определенного типа. Селективность может быть разной: могут через канал пропускаться только положительные или только отрицательные ионы, или может пропускаться, например, только натрий (или калий, или любой другой ион). Селективность определяется внутренним устройством белка.
Рассмотрим эксперимент с другим канальным родопсинов (см. рис. 6, графики, данные в пунктах А-С, не имею к нему отношения).
В этом эксперименте составы растворов следующие:
Омывающий: pH=7.5, $\mathrm{[Na]}$ = 200 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 200 ммоль/л
Внутриклеточный: pH=7.5, $\mathrm{[Na]}$ = 100 ммоль/л, $\mathrm{[K]}$ = 0 ммоль/л, $\mathrm{[Cl]}$ = 100 ммоль/л
D1  1.00 По ВАХ определите положительные или отрицательные ионы пропускает этот канальный родопсин. При помощи схем и рисунков объясните, как вы определили селективность.
Приложение